Krebsforschung: CRISPR/Cas9-System für Mutationsstudien einsetzbar

Neue Hochdurchsatz-Methode für Analyse von Krebsgenen

Krebs ist eine Erkrankung der DNA, bei der sich Hunderte oder Tausende von Mutationen in einer Krebszelle entwickeln. Dies macht es schwierig, entscheidende Mutationen von zufällig mitgeschleppten Mutationen, die als eine Art Nebenwirkung während der Krebsentwicklung entstehen, mittels DNA-Sequenzierung zu unterscheiden. Darüber hinaus können viele krebsauslösenden Gene nicht allein durch Sequenzierung identifiziert werden, weil sie zum Beispiel nicht mutiert, sondern auf andere Weise fehlreguliert sind.

Schnelles und flexibles Testen von Mutationen

In ihrer Studie entwickelten die Forscher zusammen mit Kollegen vom Wellcome Trust Sanger Institute einen neuen Ansatz, der auf der CRISPR/Cas9-Methode beruht. Sie fügten damit Mutationen in die Leberzellen von erwachsenen Mäusen ein. Die CRISPR/Cas9-Methode erlaubt Wissenschaftlern, Mutationen an beinahe jeder beliebigen Position im Genom zu erzeugen und dadurch eines oder mehrere Gene abzuschalten. „Unser neuer Ansatz ermöglicht uns, gleichzeitig mehrere potentielle Krebsgene in einzelnen Zellen zu mutieren und so Kombinationen zu testen“, sagt Prof. Roland Rad, Projektleiter am TUM Klinikum rechts der Isar und dem Deutschen Krebsforschungszentrum Heidelberg.

Die Methode ist schnell, sehr flexibel, effizient und skalierbar, so dass das Team viele Gene gleichzeitig untersuchen oder große Regionen des Genoms analysieren kann. Die Veränderung der Gene erfolgt direkt in erwachsenen Mäusen, was auch die Zucht von genetisch veränderten Mäusen überflüssig macht. „Wir entschieden uns, die Mutationen mit der neuen Methode direkt in adulten Leberzellen einzubringen. Denn das bildet besser die natürliche Krebsentwicklung ab: Wie bei den meisten menschlichen Tumoren entstehen die Mutationen ja auch erst im erwachsenen Organismus und beschränken sich nur auf einige wenige Zellen.“, erklärt Julia Weber, die zusammen mit Dr. Rupert Öllinger Erstautor der Publikation ist.

Neue Hochdurchsatz-Methode identifiziert auch fehlregulierte Gene

Das Forscherteam erstellte zuerst, basierend auf Literaturrecherche, eine Liste von bis zu 18 Genen mit bekannter oder unbekannter Bedeutung für die Entstehung von Leberkrebs. Mit Hilfe von CRISPR/Cas9 brachten sie verschiedenste Kombinationen dieser Gene in Mäuse ein und schalteten so die Gene aus. Die Tiere entwickelten dann innerhalb weniger Monate Leber- oder Gallengangskarzinome.

Dieser Ansatz bestätigte, dass eine Gruppe von Proteinen namens ARID, die die Organisation der Chromosomen beeinflussen, wichtig für die Entwicklung von Leberkrebs sind. Mutationen in einem zweiten Protein, TET2, wurden als ursächlich für den Gallengangkrebs identifiziert. Das steht im Gegensatz zu menschlichem Gallengangkrebs, wo TET2 nicht mutiert ist, sondern andere Proteine, die mit TET2 in Wechselwirkung treten. Dies zeigt, dass mit der CRISPR/Cas9 Methode menschliche Krebsgene identifiziert werden können, die selbst nicht mutiert sind, deren Funktion aber durch andere Ereignisse gestört ist und potentiell therapeutisch angegangen werden können.

Suche in „genomischen Wüsten“ wird leichter

Der CRISPR/Cas9-Ansatz des Teams könnte zudem ermöglichen, die biologische Erschließung von sogenannten „genomischen Wüsten“ voranzutreiben. Dabei handelt es sich um Regionen des menschlichen Genoms, die keine Gene aufweisen. Neuere Untersuchungen, wie das ENCODE Projekt, legen nahe, dass solche Wüsten regulatorische DNA-Regionen beinhalten, die die Aktivität von Genen kontrollieren.

„Leberkrebs weist viele DNA-Veränderungen in ‚genomischen Wüsten’ auf. Wir wissen nicht, welche davon wichtig für die Krankheit sein könnten", erklärt Dr. Rupert Öllinger. „Wir konnten zeigen, dass es nun möglich ist, solche Bereiche gezielt zu entfernen, um ihre Rolle bei der Leberkrebsentwicklung systematisch aufzudecken.“ Die Wissenschaftler wollen in Zukunft den Ansatz auch auf andere Krebsarten anwenden.


Publikation
Julia Weber, Rupert Öllinger, Mathias Friedrich, Ursula Ehmer, Maxim Barenboima, Katja Steiger, Irina Heid, Sebastian Mueller, Roman Maresch, Thomas Engleitner, Nina Gross, Ulf Geumann, Beiyuan Fu, Angela Segler, Detian Yuan, Sebastian Lange, Alexander Strong, Jorge de la Rosa, Irene Esposito, Pentao Liu, Juan Cadiñanos, George S. Vassiliou, Roland M. Schmid, Günter Schneider, Kristian Unger, Fengtang Yang, Rickmer Braren, Mathias Heikenwälder, Ignacio Varela, Dieter Saur, Allan Bradley, und Roland Rad, CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice, Proceedings of the National Academy of Sciences, October 2015.
DOI: 10.1073/pnas.1512392112

Kontakt
Prof. Dr. Roland Rad
II. Medizinische Klinik
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Technische Universität München
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